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              多聚酶二抗在 IHC 實驗中能顯著提高顯色信號

              發布時間:2022-03-01瀏覽:69次

              多聚酶二抗介紹

              過氧化物酶標記的抗體方法于 1968 年推出,是大多數臨床和研究中石蠟包埋組織抗體的實踐應用(Nakane,1968)。然而常規的二抗-HRP 結合物每個 IgG 分子上最多能結合 3 個 HRP 分子。這種結合物的分子量能滿足常規的 WB 和 Elisa 實驗要求,但在檢測目標蛋白分子量含量很低時,如果不通過額外的步驟來放大信號,會降低檢測靶標所需的靈敏度。IHC 實驗時尤為明顯。


              在過去的幾十年中,IHC 實驗用試劑和實驗方案上的改進增加了這套檢測系統的靈敏度?;诿?抗-酶免疫復合物技術(PAP 和 APA-AP)(Sternberger et al., 1970)和標準的抗生物素蛋白 / 鏈霉抗生物素蛋白-生物素-復合物技術(ABC 或 SABC)以及標記的鏈霉素-生物素(LSAB)技術,再通過多聚酶結合,這種新方法使檢測抗原的能力比之前提高好幾倍。

              然而 PAP 和 APA-AP 方法會形成巨大的骨架結構導致檢測物質體積過大而容易發生遮蔽和位阻現象(如細胞核抗原的檢測),使其難以進入到組織樣品內部而導致靈敏度降低(for review see: Shi et al., 1999 and citations therein)。

              人體內很多組織分布有生物素(維生素 H),它可以和 ABC/SABC 結合產生非特異性染色。同時為了減少實驗步驟,加強信號,需要一種容易滲透到組織內部,降低非特異反應,并能提高信號強度的檢測系統來代替傳統的方法。

              FineTest® IHC Kits 采用了一種新的多聚酶二抗系統(包括 poly-HRP 羊抗兔 IgG 和 poly-HRP 羊抗小鼠 IgG)。更多的酶可以通過鏈接臂結構鏈接到單分子的抗體上,形成最合適的復合物結構,從而在免疫組化實驗中提高信號強度,同時簡化了實驗程序。


              各檢測系統的差異:

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              顯色對比試驗

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              原理示意圖:

              IHC 測試結果
              分別進行了高濃度和低濃度的目標抗原 IHC 實驗。其中一抗,多聚酶二抗和 DAB 試劑盒均來自FineTest®。
              較高濃度的目標抗原:


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               較低濃度的目標抗原:


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              人體腎臟組織A,D,F,N),人體肝癌組織B,E),人體乳腺癌組織C,J,K), 人體結腸癌組織H,I,L,M) 和大鼠心臟組織G)。多聚酶二抗 Poly-HRP Goat anti rabbit IgGPoly-HRP Goat anti mouse IgG 按照 1:100 稀釋。DAB 染色 10 分鐘,細胞核用蘇木-精復染。

              陰性對照試驗

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              人體心臟組織1),人體結腸癌組織2),大鼠肝臟組織3),人體乳腺癌組織4)。一抗為陰性血清,多聚酶二抗 Poly-HRP Goat anti rabbit IgGPoly-HRP Goat anti mouse IgG 按照 1:50 稀釋。DAB 染色 10 分鐘,細胞核用蘇木-精復染。

              總結
              使用多聚酶二抗做 IHC 實驗,獲得了明顯放大的信號,未出現非特異性結合,并且大大簡化了實驗程序。




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